Презентация - "DNK ni restriktaza fermentlari yordamida fragmentlarga bo‘lish"

O‘ZBEKISTON RESPUBLIKASI
OLIY VA O‘RTA TA’LIM VAZIRLIGI
VETERINARIYA VA CHORVACHILIKNI RIVOJLANTIRISH DAVLAT QO‘MITASI
O‘ZBEKISTON RESPUBLIKASI
OLIY VA O‘RTA TA’LIM VAZIRLIGI
VETERINARIYA VA CHORVACHILIKNI RIVOJLANTIRISH DAVLAT QO‘MITASI
 
SAMARQAND VETERINARIYA MEDITSINASI INSTITUTI
 
DNK ni restriktaza fermentlari yordamida fragmentlarga bo‘lish

AKBAROVA GULIRUXSOR VAFOEVNA
 

 

Kerakli jihoz, reaktiv va asbob uskunalar: Turli ulchamdagi probirkalar, kolbalar, pinset, qaychi, mikroigna, tayyor va vaqtinchalik preparatlar, kimyoviy moddalar, refraktometr, dializ qog‘ozi, magnitli aralashtirgich, spektrofotometr va muzlatgich va boshqalar

Restriktazalar. Hozirgi vaqtda turli xil mikroorganizmlardan mingdan ortiq har xil restriktazalar ajratib olingan. Gen muhandisligida 200 dan ortiq turi keng qoʻllanilmoqda. Restriktazalar endonukleazalarning DNKni muayyan maxsus ketma-ketliklari restriksiya saytlari (nuqtalari)ni hosil qilib gidroliz qiladigan guruhi hisoblanadi. Har bir restriktaza oʻzining restriksiya saytini taniydi va DNKni restriksiya sayti izchilliklari ichidan yoki uning atrofidan boshlab qirqadi

Ba’zi restriktazalar va ular tanib kesadigan izchilliklar

Restriktazalar nukleotid ketma-ketliklarini qirqishiga koʻra, bir necha tipga boʻlinadi. I-tipdagi restriktazalar restriksiya saytlarini taniydi, lekin tanib olgan saytdan ixtiyoriy masofada (bir necha oʻndan to bir necha yuz ming nukleotid juftlarga qadar) qirqadi. Bunday restriktazalarni gen muhandisligi muammolarini hal etishda qoʻllab boʻlmaydi. III-tipdagi restriktazalar ham I-tipdagi restriktazalarga oʻxshaydi, ular DNKni tanib olingan saytdan 20-35 n.j. masofada gidroliz qiladi, shuning uchun ham amaliy maqsadlarda kam foydalaniladi.

Rekombinant molekulalar shundaki, olish uchun asosan II-tipdagi restriktazalar qoʻllaniladi. Bunday restriktazalarning asosiy tavsifi ularning tanish sayti va qirqish joyi bir-biriga mos keladi. II-tipdagi restriktazalar muayyan nukleotid ketma-ketliklarni DNK dan tanib oladi va uni restriksiya sayti izchilligi ichidan boshlab gidrolizlaydi. II-tipidagi restriktazalarning restriksiya saytlari1800 aylanishdagi simmetrik ketma-ketliklar- palindromlardan iborat.
5′ GAATTC 3′
3′ CTTAAG 5′EcoR I restriktazasi restriksiya sayti.
5′TAGA 3′
3′ATCT 5′ Taq I restriktazasi restriksiya sayti.
II-tipdagi restriktazalar restriksiya saytlari oʻlchami va olinadigan DNK boʻlaklari uzunligiga koʻra, bir necha sinfga boʻlinadi:

DNKni fragmentlarga (qismlarga) boʻlish. Istalgan tabiiy DNK endokunmaza fermentlari yordamida “maydalanishi” mumkin, endonukleaza fermentlari ichida restriktazalar (restriktasion endokulmazalar) alohida oʻrin egallaydi. Bu fermentlarni biologik roli masalan: prokariotlarda hujayraga chetdan kirgan DNK boʻlagini gidrolizlashdan iborat. Bunda hujayrani oʻrini xromasom DNK si oʻzgarmasdan qoladi. Buni madifikatsion metilaza fermentlari borligi bilan tushuntiriladi. Bu metilazalar xromasomani koʻp boʻlmagan spesifik saytlaridan A yoki S metillanish reaksiyasini katalizlaydi, natijada metillangan DNK restriktazalar hujumiga sezgirligi boʻladi. Metil guruhlarni tashuvchisi boʻlib S–adenozil L–metionin (SAM) hisoblanadi.

Hozirgi vaqtda 500 tadan ortiq restriktazalar ma’lum boʻlib ularni koʻpchiligini spesifikliligi aniqlangan. Koʻpchilik restriktazalar biotexnologiyani oxirgi mahsuloti sifatida ishlab chiqariladi masalan: Sigma (AQSh), Pharmacia (Shvesiya), Serva (Germaniya) va boshq. Bu fermentlar DNK ni spesifik qismlarini (saytlarni) tashib va ularni “tumtoq” yoki “yopishqoq” uchlar hosil qilib parchalash xususiyatiga ega.
Restriktazalarni tashish ketma–ketligini uzunligiga qarab 3 ta guruhga ajratilar edi.
1. Tetranukleotidlarni tashiydigan, masalan Arthrobacter luteus dan olingan Alu I
2. Pentanukleotidlarni tashiydigan, masalan E coli dan olingan Eco RI
3. Gegsanukleotidlarni tashiydigan, masalan E coli dan olingan EcoRII.

Alu I DNK dagi AG/ST ketma–ketligini toʻmtoq uchlar hosil qilib parchalaydi, Eco RII va Eco RI SS (A/T) GG va G-AATTS ketma–ketligini yopishqoq uchlar hosil qilib parchalaydi. Hozirgi vaqtda restriktazalarni RMS–sistemani hisobga olgan holda 3 ta sinfga boʻlinadi. Bunda RMS restreksiya oqsillari, metillash va ekish. Birinchisiga DNK ni istalgan joyidan turli DNK boʻlaklarini hosil qilib parchalaydi, ikkinchisiga (500 ga yaqin turi aniqlangan) restriksiya va ekish saytlari bir–biriga mos keladi–RS–MS. Hosil boʻlgan boʻlaklar restriktlar deb ataladi. Bu guruhlardagi restriktazalar amaliyotda koʻproq qoʻllaniladi.
III guruh restriktazalar boshqa xamma restriktasion endonukleazalarni birlashtiradi. Bularni amaliyotda kamdan–kam ishlatiladi.

Restriktazalar DNK ni (4–nukleotidlar–A, G, G, S; n–DNK dagi saytlarni takrorlanishi) formuladan kelib chiqqan holda taxminan xar 250 nukleotidda kechadi. Coyenorabiditis yelegaus dan olingan 160 mkg DNK dan 2–4 mkg DNK boʻlagini olish mumkin.
Olingan restriktlarni (ayniqsa yopishqoq uchli) DNK–ligazalar yordamida tikish mumkin. Kerak boʻlsa, yopishqoq uchlar kuydiriladi (kuydirish–bu oʻziga xos komplementlar rayessasiyasiya boʻlib natijada 2 zanjirli molekulalar hosil boʻladi):
Nukleotidlar orasidagi boʻshliqda ligaza fermentlar yordamida hosil qilinadigan fosfodiefir bogʻlari yoʻq, bu fermentlar 31 va 51 gidroksil guruhlar hisobiga boradigan reaksiyalarni katalizlaydi.

DNK boʻlaklarini tikish uchun linker (lig. Link–bogʻlash) va adoptorlardan foydalaniladi. Linker–bu ikkilamchi zanjirli sintetik oligonukleotid boʻlib, bir qator restriktazalar taniydigan saytlarni taniydi. Adoptor bu–restriktaza taniydigan bittadan ortiq sayt saqlaydigan linkerdir va adaptor uchlari bir–biriga toʻgʻri kelmaydigan DNK boʻlaklarini birlashtirish xossasiga ega. DNK restriksiyasi keyin hosil boʻladigan uchlari toʻmtoq boʻlaklar TU folidan olingan DNK–ligaza ta’sirida osonlikcha birikadi. Genetik muhandislikda nusxa DNK ni ajratish kerak. nDNK mRNK ni va vektorni nusxasi boʻlib, xromasom yoki genom klonlarni oʻzida saqlaydi. Genomni hammasini klonlashda qisqa nukleotidlar ketma–ketligini taniydigan restriktazalar yordamida boʻlinadi. Parchalash shunday sharoitda olib boriladiki, bunda DNK qisman restriksiyaga uchaydi. Hosil boʻlgan boʻlaklar har–xil uzunlikda boʻladi ammo bir xil ketma–ketlik bilan tugaydi. Genda yopishqoq uchlarni boʻlishi uni klonlashda katta qulaylik yaratadi. Genomni boʻlingan genlarni klonlash vektoriga terilib (ximerlar toʻplami) chegaralanmagan vaqt saqlanishi mumkin. Bunday DNK ni klonlangan boʻlaklarni “genom kutubxonasi” deb ataladi.

Etiboringiz uchun rahmat